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Bei dem Telomer Length Assay handelt es sich um eine Methode zur Feststellung der Telomerlängen mittels eines Southern Blot. In unserem Versuch untersuchen wir die Telomerlängen aus den Lymphocyten eines Säuglings, einer Jugendlichen und aus einem Osteosarkom (bösartige Geschwulst knochenbildender Zellen) mit Telomeraseaktivität eines älteren Menschen. Zuerst wird die isolierte DNA mit den beiden Restriktionsenzymen Hinf I (GANTC) und Rsa I (GTAC), die u.a. in der DNA-Sequenz in der Nähe der Telomere schneiden, verdaut. Danach werden die drei DNA-Proben jeweils getrennt voneinander auf ein Agarosegel aufgetragen. Eine weitere Geltasche wird zum Längenvergleich mit einem DNA-Marker bekannter Länge bestückt. Mit Hilfe der Gelelektrophorese werden die beim DNA-Verdau entstandenen DNA-Fragmente nach ihrer Länge getrennt. Anschließend erfolgt eine Denaturierung der DNA-Fragmente durch Alkalibehandlung . Da Agarosegele sehr empfindlich sind und die DNA innerhalb des Gels diffundieren kann, wird nun ein präziser Abklatsch des Gels auf eine widerstandsfähige Boehringer-Membran erstellt. Hierdurch werden die DNA-Fragmente auch immobilisiert. Nun hybridisiert man die einzelsträngigen DNA-Fragmente mit markierten einzelsträngigen DNA-Sonden in einem Folienbeutel, der eingeschweißt wird. Die Sonden haben eine komplementäre Sequenz zu den Telomerenden, so dass genau diese später sichtbar gemacht werden. Nicht gebundene Sonden werden abgewaschen. Anschließend wird die Boehringer-Membran auf einen Röntgenfilm gelegt. Jetzt sind die verschiedenen Telomer-DNA-Fragmente als Bande auf dem Film sichtbar. |
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Telomere Uhren |
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1. Einleitung 5. Telomeraseaktivität in Tumoren |
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