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5. Telomeraseaktivität in Tumoren

5.1. Messung der Telomeraseaktivität durch das TRAP Assay

5.1.1. Versuchsaufbau und -durchführung

Zur Messung der Telomeraseakitivität dienten uns zwei Proben. (Zellen aus einem bei Kindern vorkommenden Ewing Knochentumor und Blut der Schülerin Wiebke Storck). Die Aktivität der Telomerase haben wir durch das TRAP Assay (Telomeric Repeat Amplification Protocol) bestimmt.
Dabei werden zunächst alle Proteine aus den Proben isoliert. Um gleiche Gesamteiweißkonzentrationen in den beiden Ansätzen zu erhalten und damit vergleichbar zu machen, wird deren optische Dichte gemessen und mit der optischen Dichte einer bekannten Eiweißkonzentration von bovinem Serumalbuminalbumin verglichen. Durch eine entsprechende Verdünnung wird die Eiweißkonzentration in beiden Proben angeglichen. Neben vielen anderen Proteinen ist in diesen Proben möglicherweise das Enzym Telomerase vorhanden.
Bei dem TRAP Assay erfolgt der Nachweis von Telomerase nicht durch Isolierung des Enzyms sondern durch den Nachweis seiner Wirkung.
Hierzu verwendet man einsträngige fluoreszierende TS-Primer, deren Basensequenz am 3` Ende der Telomersequenz entspricht, außerdem ein Nukleotidmix , hitzestabile DNA-Taq-Polymerase) und weitere (reverse) Primer.
Bei Temperaturen von 37 und später 30° Celsius verlängert nun - falls vorhanden - die Telomerase die TS-Primer.

Nach 35 Minuten wird das Reaktionsgemisch auf 94° Celsius erhitzt. Dabei wird u.a eine eventuell vorhandene Telomerase denaturiert. Die Reaktion wird gestoppt.
Die DNA wird nun mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion vervielfältigt. An die unterschiedlich verlängerten DNA-Fragmente lagern sich reverse Primer und Basen an und der DNA-Strang wird mit Hilfe der DNA-Taq-Polymerase in 5'-3'-Richtung repliziert.

Die DNA-Fragmente werden auf ein Acrylamidgel aufgetragen und ihre Länge mit Hilfe des Alf-Expresses (Automated Laser Fluorescence-Sequencer) bestimmt. Mit diesem Gerät erfolgt eine automatische Erkennung von fluoreszenzmarkierten DNA-Molekülen durch einen Laser mittels elektrophoretischer Trennung.
Bei der Alf-Lauf-Fragmentanalyse wird die Länge von DNA-Stücken durch den Zeitpunkt bestimmt, an dem sie den Laser passieren, das heißt, je kürzer die DNA-Fragmente, desto früher werden sie am Laser "vorbeilaufen" und von diesem erfaßt. Gleichzeitig kann auch die Konzentration der DNA-Fragmente bestimmt werden. Je höher die Peaks der Graphen sind, desto höher ist die Anzahl der gemessenen DNA-Fragmente.